[单细胞转录组分析系列教程 8] 怎么做单细胞marker基因识别？

大家早上好，我们继续讲单细胞 单细胞转录组分析。

在完成聚类分析之后，单细胞研究面临的下一个关键问题是：每个聚类代表什么样的细胞类型？Marker基因识别正是回答这个问题的核心工具。Marker基因是能够区分不同细胞群体的特征性基因，它们在特定细胞类型中高表达，而在其他细胞类型中表达较低或不表达。通过识别每个聚类的marker基因，我们不仅能够为聚类赋予生物学意义，还能验证聚类结果的合理性，为后续的细胞类型注释、功能分析和机制研究做准备。

# 加载必要的包
library(Seurat)
library(ggplot2)
library(dplyr)
library(patchwork)
library(pheatmap)

# 基于前面步骤完成的聚类分析结果
print(paste("准备进行marker基因识别：", ncol(scRNA), "个细胞，", length(unique(Idents(scRNA))), "个聚类"))

Marker基因识别的核心是差异表达分析，但它与传统的组间比较有所不同。在marker基因分析中，我们要找的不是两组条件下的差异基因，而是能够定义每个细胞群体特征的基因。这要求我们使用特殊的统计方法和筛选标准：基因不仅要在目标聚类中高表达，还要在足够比例的细胞中检测到，同时在其他聚类中的表达要相对较低。

Seurat中的FindAllMarkers函数采用了多种统计检验方法，包括Wilcoxon秩和检验、ROC分析、t检验等。不同的方法各有优势：Wilcoxon检验适合处理单细胞数据的零膨胀特性；ROC分析能提供分类性能的直观评估；t检验在数据分布相对正常时效果较好。在实际分析中，我们通常选择最适合数据特征的方法。

# 为了加快演示，对数据进行采样
set.seed(123)
sample_cells_for_markers <- sample(colnames(scRNA), min(3000, ncol(scRNA)))
scRNA_subset <- scRNA[, sample_cells_for_markers]

# 使用快速方法识别marker基因
all_markers <- FindAllMarkers(scRNA_subset, 
                             only.pos = TRUE,
                             min.pct = 0.25,
                             logfc.threshold = 0.5,
                             test.use = "roc",
                             verbose = FALSE,
                             max.cells.per.ident = 100)

参数设置对marker基因识别的结果有重要影响。 only.pos = TRUE 表示只保留正向marker（在目标聚类中高表达的基因），这是最常用的设置，因为我们通常关心的是细胞类型的特征性高表达基因。 min.pct = 0.25 要求基因至少在25%的细胞中表达，这能过滤掉那些只在少数细胞中偶然高表达的基因。 logfc.threshold = 0.5 设置了倍数变化的最小阈值，确保差异具有生物学意义。

ROC检验（test.use = "roc"）是一个特别适合单细胞数据的方法，它将基因表达作为分类器，计算其区分目标聚类与其他聚类的能力。ROC曲线下面积（AUC）越接近1，表示该基因的分类能力越强，越适合作为marker基因。

图 1 Top marker基因表达热图：展示了各聚类最具代表性的marker基因表达模式，每行代表一个基因，每列代表一个细胞。

热图清晰地展示了marker基因的特异性表达模式。每个聚类都有其独特的基因表达"指纹"，这些基因在对应的聚类中呈现高表达（红色），而在其他聚类中表达较低（蓝色）。这种特异性表达模式正是我们进行细胞类型注释的基础。

从热图中可以观察到几个重要特征：首先，不同聚类的marker基因很少重叠，这表明聚类结果具有良好的生物学意义；其次，某些聚类的marker基因数量较多，可能代表功能更加活跃或特化程度更高的细胞类型；最后，基因表达的层次聚类结果与细胞聚类基本一致，验证了分析的可靠性。

# 选择具有代表性的marker基因进行可视化
example_markers <- c("CD68", "CD3E", "CD79A", "ALB")
available_markers <- example_markers[example_markers %in% rownames(scRNA)]

# FeaturePlot显示marker基因表达
p_feature <- FeaturePlot(scRNA, features = available_markers, 
                        ncol = 2, raster = FALSE)

图 2 代表性marker基因的空间表达分布：在UMAP空间中展示了不同marker基因的表达强度和分布模式。

FeaturePlot提供了marker基因表达的空间分布信息。每个marker基因都显示出明确的空间聚集模式，高表达区域与特定的细胞聚类区域高度重合。这种空间一致性是优质marker基因的重要特征，表明这些基因确实能够准确定义细胞群体的身份。

CD68作为经典的巨噬细胞marker，在UMAP空间的特定区域呈现高表达，这些区域很可能对应库普夫细胞或其他巨噬细胞亚群。CD3E作为T细胞的通用marker，在另一片区域集中表达，标记了T细胞聚类。这种marker基因与细胞聚类的对应关系为细胞类型注释提供了直接的证据。

# VlnPlot显示marker基因在各聚类中的表达分布
p_violin <- VlnPlot(scRNA, features = available_markers, 
                   ncol = 2, pt.size = 0.1)

图 3 Marker基因在各聚类中的表达分布：小提琴图显示了marker基因在不同聚类中的表达水平分布和变异程度。

小提琴图提供了marker基因表达的定量比较信息。理想的marker基因应该在目标聚类中显示高表达和相对集中的分布，而在非目标聚类中表达较低且变异较小。从图中可以看到，优质的marker基因确实表现出这种特征：它们在特定聚类中形成明显的表达峰，而在其他聚类中基本不表达或表达很低。

这种表达模式的差异不仅反映了基因的特异性，也暗示了不同细胞类型的功能特化。例如，如果某个基因在多个聚类中都有中等水平的表达，它可能不是理想的marker基因，但可能在多种细胞类型的某个共同功能通路中发挥作用。

# DotPlot显示多个marker基因
top1_markers <- all_markers %>%
  group_by(cluster) %>%
  slice_max(order_by = avg_log2FC, n = 1) %>%
  pull(gene)

p_dotplot <- DotPlot(scRNA, features = top1_markers) + coord_flip()

图 4 Top marker基因表达点图：点的大小表示表达基因的细胞比例，颜色深浅表示平均表达水平。

DotPlot是展示marker基因特征的另一种有效方式，它同时显示了两个重要信息：基因表达的强度（颜色）和表达的普遍性（点大小）。理想的marker基因应该在目标聚类中表现为大而深的点（高表达且在多数细胞中检测到），而在其他聚类中表现为小而浅的点或无点。

这种可视化方式特别适合比较多个基因在多个聚类中的表达模式，帮助我们快速识别每个聚类最具代表性的marker基因。同时，它也能揭示基因表达的异质性：即使在同一聚类中，不同基因的表达普遍性也可能存在差异。

# 统计每个聚类的marker基因数量
marker_count <- all_markers %>%
  count(cluster, name = "n_markers")

p_count <- ggplot(marker_count, aes(x = cluster, y = n_markers, fill = cluster)) +
  geom_col(alpha = 0.8) +
  geom_text(aes(label = n_markers), vjust = -0.3, size = 3)

图 5 各聚类的marker基因数量统计：柱状图显示了每个聚类识别到的marker基因数量，反映了不同细胞群体的转录特异性程度。

Marker基因数量的差异反映了不同细胞群体的转录特化程度。某些聚类拥有大量的marker基因，表明这些细胞类型具有独特且丰富的转录程序；而某些聚类的marker基因较少，可能表示这些细胞处于相对通用的状态，或者与其他细胞类型的差异较小。

在我们的分析中，总共识别到3,871个marker基因，平均每个聚类约204个marker基因。这个数量是合理的，既保证了每个聚类都有足够的特征基因用于注释，又避免了过度包容导致的特异性下降。

marker基因数量的不均匀分布也提供了生物学洞察：marker基因较多的聚类可能代表高度特化的细胞类型，如特定的免疫细胞亚群或功能特化的组织细胞；而marker基因较少的聚类可能代表干细胞、祖细胞或处于过渡状态的细胞。

Marker基因识别是连接无监督聚类与生物学解释的关键桥梁。通过系统化的差异表达分析和多角度的可视化验证，我们不仅能够为每个细胞聚类找到其特征性的分子标签，还能深入理解不同细胞类型的功能特点。这些marker基因将成为后续细胞类型注释、功能分析和机制研究的重要依据。

总结

• 方法选择要合适 ：ROC分析等适合单细胞数据特点的统计方法更加可靠
• 参数设置很关键 ：合理的阈值设置能够平衡灵敏度和特异性
• 多维验证必须 ：热图、散点图、小提琴图等多种可视化相互验证
• 生物学解释优先 ：marker基因必须与已知的细胞类型标志基因相符合

Marker基因识别将抽象的数字聚类转化为具体的生物学实体，为单细胞数据的深入解析提供了科学的基础。正确的marker基因不仅能够准确定义细胞身份，还能为理解细胞功能、发现新的细胞亚型以及探索疾病机制开辟新的道路。

完整代码联系老师免费获取（备注“单细胞转录组”）

以上就是今天的内容，希望对你有帮助！欢迎点赞、在看、关注、转发。