上一篇文章中，我们讲了为什么要做GSEA富集分析，今天跟大家聊一下GSEA基因集富集分析的原理，以及GSEA图如何看。
我们先简单过一下GO/KEGG的不足。主要有两个：
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依赖差异基因筛选： 只关注显著上调/下调的基因（如p<0.05），忽略表达变化微弱但生物学意义重要的基因。如果某个基因的p值等于0.51，那么这个基因就不会加入富集分析。 -
无法捕捉整体趋势： 在差异表达分析结果中根据log2FC筛选出来的差异基因，然后用这些差异基因做GO/KEGG富集分析，富集到的通路中参与的基因有些是上调的，有些是下调的，因此我们无法判断在该通路的整体趋势
由于上面这两个原因，所以引进了GSEA基因集富集分析。
基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）不需要预先筛选差异基因，直接分析所有基因在排序列表中的分布模式，挖掘基因集（如通路、功能模块）的协同变化规律。我们一起看一下GSEA的原理。
GSEA的核心原理：从“排序基因”到“富集信号”
GSEA的数学逻辑，主要包含以下三步
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基因排序 -
根据基因在两组样本中的差异程度（如log2FC、信号强度）从高到低排序。 -
例如：肿瘤vs正常组织中，按差异基因表达量的倍数变化log2FC从“最强上调”到“最强下调”排序。 -
富集得分（Enrichment Score, ES）计算 -
从排序列表的顶端开始“行走”，遇到基因集中的基因则加分，否则减分。 -
最终ES值为路径中的最大偏离值（反映基因集的富集程度）。 -
核心思想：检验目标基因集是否集中在排序列表的顶部（显著上调）或底部（显著下调）。
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显著性评估 -
置换检验（Permutation Test）：通过随机打乱样本标签或基因标签生成背景分布，计算ES的显著性（p值）。 -
多重检验校正：控制假阳性率（常用FDR值）。
GESA富集分析后，得到下面的结果图，我们来解读这个结果图
可以看到，我们一个选择5个KEGG的通路基因集做GSEA富集分析
这个图主要分3部分
第1个部分是 富集分数折线图
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横轴（x轴） ： 基因按差异程度排序的位置（从左到右，差异从大到小）。 -
纵轴（y轴） ： 实时累积分数的变化（反映目标基因集的富集趋势）。 -
关键点 ： -
ES值 ：折线图中距离零点的最大偏差（峰顶或峰谷），代表富集强度。 -
红色虚线 ：ES值对应的位置，左侧为核心基因（ES>0表示基因集显著上调，ES<0表示下调）。
第2个部分是 Hits图（条形码图）
显示目标基因集中每个基因在排序列表中的具体位置，比如图中的绿色通路 KEGG_OLFACTORY_TRANSDUCTION ，在中间部分的条形码图中，如果 KEGG_OLFACTORY_TRANSDUCTION 通路的基因集命中排序后的差异基因，则在对应的基因位置画条形(即绿色的竖线)
第3个部分 Rank指标分布图
展示所有基因的排序指标值分布（如log2FC）。
Rank指标可以是log2FC，信噪比等等，具体看代码选择的方法，但是Rank指标的本质就是能显示两组间的差异的一种数值。
通过这三部分图，可以直观判断目标基因集是否在实验数据中显著富集，以及其表达变化趋势（上调/下调）。比如绿色、青色、深红色的通路是上调的，而蓝色和浅红色的通路是下调的
总结一下，GSEA（基因集富集分析）通过直接分析所有基因在排序列表中的分布模式，解决了传统GO/KEGG富集分析的不足：即无需依赖差异基因筛选，能够捕捉基因集的整体协同变化趋势。其核心原理包括基因排序、富集得分（ES）计算和显著性评估，最终通过富集分数折线图、条形码图和Rank指标分布图直观展示结果。GSEA能发现显著上调或下调的通路，还能揭示微弱但一致的基因集变化。
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