为什么需要做GSEA/GSVA分析？GO/KEGG分析的不足！

之前讲了GO和KEGG富集分析，今天补充一个GSEA/GSVA分析。

先说结论

为什么需要 GSEA/GSVA分析？

主要还是GO/KEGG分析存在局限：

1. 阈值依赖性 ：依赖差异基因筛选（如p<0.05，|log2FC|>1），忽略未达阈值但具有协同效应的基因（如log2FC=0.8的群体），且结果对阈值微小变动高度敏感，导致信息丢失和稳健性不足；
2. 基因冗余与通路重叠 ：基因多效性（如TP53参与多个通路）导致富集结果冗余，难以区分核心通路与非特异性关联；
3. 静态分析限制 ：将样本视为同质群体，无法解析亚群特异性通路动态变化（如肿瘤分期差异），且缺乏通路活性与临床表型的直接关联。比如GSEA在未达差异阈值的基因中检出免疫检查点通路富集，而GO分析未能识别此类信号。

GSEA是什么，相对于 GO/KEGG分析有什么优势？

传统富集分析仅统计差异基因数量，忽略基因表达量的变化方向和程度（如：某通路中既有显著上调基因，也有下调基因，整体效应难以判断）

基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）是一种基于全基因组表达数据的通路富集方法，旨在解决传统差异基因筛选导致的信号丢失问题。其核心思想是： 生物学功能通常由多个基因协同调控，即使单个基因变化微弱，基因集的整体协调变化仍可能具有显著意义 。

GSEA通过以下三步实现分析：

1. 基因排序 ：根据基因与表型的关联程度（如log2FC、信号值差异或相关性）对所有基因排序，构建有序基因列表；
2. 富集评分计算 ：沿排序列表滑动窗口，计算目标基因集（如KEGG通路）在列表顶部或底部的富集程度，通过加权Kolmogorov-Smirnov检验生成富集分数（Enrichment Score, ES），反映基因集在表型相关区域的聚集性；
3. 显著性评估 ：通过样本或基因标签置换（permutation test）计算p值，并校正多重假设检验（如FDR），确保结果的统计学可靠性。

与传统方法相比，GSEA的突出优势在于

• 无需预设阈值，避免因差异基因筛选丢失亚阈值基因的协同信号；
• 检测灵敏度更高，可识别微弱但一致的基因集变化（如10个基因均log2FC≈0.5）；
• 结果解释性强，通过基因集在排序列表中的分布模式（如集中于高表达区），揭示通路激活/抑制方向。

为什么还要加做GSVA分析？

基因集变异分析 （Gene Set Variation Analysis, GSVA）是一种非参数、无监督的基因集富集方法，通过量化单个样本在特定通路或功能模块中的活性，突破传统富集分析的群体水平限制。其核心原理是将基因表达矩阵转换为通路活性矩阵，为每个样本生成独立的通路评分，从而支持样本层面的动态异质性解析。

虽然GSEA在基因集富集分析中具有显著优势，但其核心局限性在于 依赖样本分组比较 （如肿瘤vs正常），仅能评估基因集在群体水平的整体富集趋势，而 无法量化单个样本的通路活性 。例如，在异质性较强的肿瘤队列中，GSEA虽能识别“EMT通路在转移组显著激活”，但无法揭示哪些患者个体驱动了这一现象，亦不能关联通路活性与患者临床特征的动态变化（如生存期、药物敏感性）。

GSVA相对于GSEA的优势 ：

• 单样本活性解析 ：基于基因表达数据，独立计算每个样本的通路评分，支持样本特异性分析（比如患者A的WNT通路评分=2.3，患者B=0.8）
• 动态异质性建模 ：通过比较亚群间评分差异（比如Ⅲ期vsⅠ期肿瘤）、构建通路-临床关联网络（比如高血管生成评分→短生存期），揭示驱动表型的核心机制
• 跨组学整合潜力 ：通路评分矩阵可直接用于单细胞测序（解析细胞亚群功能状态）、空间转录组（定位通路活性空间分布）或多组学联合分析。

总的来说

• GSEA ：回答“哪条通路在组间存在整体差异？”
• GSVA ：回答“哪些样本/亚群驱动了通路变化？如何关联临床结局？”

总结一下

GO/KEGG分析因阈值依赖性和静态限制，难以捕捉微弱信号和样本异质性。GSEA通过全基因排序和富集评分，解决了阈值依赖问题，识别组间通路差异；GSVA进一步量化单样本通路活性，支持动态异质性解析和临床关联分析。结合多种富集分析，可以从群体差异到个体化机制，不同层次解读生物学意义。

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