在RNA-seq实验设计中，研究者需要在单端测序（single-end）和双端测序（paired-end）之间做出选择。虽然双端测序的成本更高，但其在数据质量和分析深度方面的优势，使其成为大多数转录组研究的首选策略。
图 1 单端与双端测序的比对精度比较：双端测序在各种读长下都表现出更高的比对准确性。
双端测序的技术优势
双端测序从DNA片段的两端同时进行测序，产生一对具有方向性的reads。这种设计提供了单端测序无法获得的额外信息：插入片段长度、reads间的距离关系，以及更强的序列上下文约束。
在基因组比对过程中，双端reads的配对信息显著提高了比对的唯一性和准确性。当单个read可能比对到多个基因组位置时，其配对read的位置信息能够帮助确定正确的比对位置，从而减少多重比对的模糊性。
插入片段信息的价值
图 2 双端测序中插入片段大小的分布特征：大部分片段集中在最适范围内。
双端测序提供的插入片段长度信息对转录组分析具有重要意义。通过分析插入片段的分布，研究者可以评估文库构建的质量，检测实验中的技术问题，并为后续分析提供质控依据。
更重要的是，插入片段信息使得双端测序能够检测到跨越较大内含子的转录本，发现新的剪接变体，甚至识别基因融合事件。这些分析在单端测序中是难以实现的。
成本效益权衡
图 3 不同测序策略的成本与数据质量权衡：双端测序虽然成本更高但数据质量显著提升。
虽然双端测序的成本约为单端测序的1.5-2倍，但其提供的数据质量改善往往超过成本的增加。在差异表达分析中，更高的比对精度直接转化为更可靠的定量结果和更低的假阳性率。
图 4 测序策略选择的决策流程和各自适用场景。
对于预算充足的研究项目，双端测序几乎总是更好的选择。即使在预算有限的情况下，考虑到数据质量对后续分析的影响，双端测序通常仍是更经济的长期投资。
最后我们总结下
双端测序通过提供配对reads信息和插入片段数据，显著提升了转录组分析的准确性和深度。虽然成本较高，但其在数据质量方面的优势使其成为现代转录组学研究的标准选择。在实验设计时，应优先考虑双端测序策略。
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