大家下午好，今天跟大家聊一个WGCNA的问题，是在昨天一个学生来问的，大概就是对WGCNA的输入数据有疑问，问我用Count还是TPM？其实用这两种数据都可以处理用来做WGCNA，但是需要做合适处理，但我觉得更本质的问题是：“ 做每一个分析时，具体要用哪种形式的数据？ ”。比如，TPM数据可以用来做跨样本分析，因为TPM已经去除测序深度、基因长度和批次的影响，只需要就行log2(TPM+1)转换后就可以用来做WGCNA；但是Count是原始数据，没有处理测序深度、基因长度等影响，能用来做WGCNA分析吗？先说结论，可以，而且只需要处理 测序深度即可。
下面我们一起来看为什么Count数据可以做 WGCNA。
WGCNA分析的目标，是在成千上万的基因里，找到那些表达模式总是同步变化的“基因搭档”。它核心关注的，不是哪个基因的绝对表达量更高，而是它们的表达节奏是否合拍。
这种对“节奏”相似性的判断，主要靠的是一种叫 相关性 分析 的数学方法。
问题来了：基因长度带来的“先天优势”
在基因测序（RNA-seq）的世界里，基因的长度会带来一个很“不公平”的现象。一个更长的基因，即使其真实表达水平与一个短基因完全相同，也更容易获得更高的测序计数值。
所以，当我们用
vst
或
rlog
这些方法处理完数据后，虽然校正了每个样本的“整体测序环境”（测序深度），但每个基因因自身长度不同而带来的“先天优势”还在。
这看起来似乎很不公平，对吧？
补充一下：那原始的Count数据呢？为什么不能直接用？
在讨论基因长度之前，我们必须先明确一个更基础的问题：
为什么我们不直接用最原始的
Count
数据来做相关性分析？
直接使用原始
Count
矩阵是
绝对错误
的，因为它存在几个致命的问题，会彻底摧毁相关性分析的可靠性：
-
测序深度差异 ：这是最大的问题。样本A可能测了2000万条reads，样本B只测了1000万条。这会导致样本A中所有基因的Count值都系统性地比样本B高出一倍左右。这种巨大的技术性差异会掩盖所有真实的生物学模式，导致你找到的“搭档”基因，仅仅是因为它们在测序深度高的样本中数值都偏高而已。 -
方差与均值强相关 ：在Count数据中，表达量越高的基因，其数值波动范围（方差）也越大。这违反了相关性分析的基本假设。如果不加处理，那些高表达的“明星基因”会不成比例地主导整个网络的构建，而大量低表达但可能有重要协同功能的基因则会被忽略。 -
数据非连续且高度偏斜 ：原始计数值是离散的整数，且分布极不均匀。相关性分析在处理近似连续、对称分布的数据时效果最好。
因此，我们必须先通过
vst
或
rlog
等函数对原始
Count
数据进行转换
。这些转换的目的，正是为了解决上述三个核心问题：校正测序深度、稳定方差、使数据更接近连续分布。
为什么经过转换后，我们就可以“不在乎”基因长度了？
现在，我们有了一个经过
vst
或
rlog
处理好的、干净的数据。我们知道，基因长度这个“先天优势”还在里面，但为什么此时我们可以“无视”它了呢？
因为 相关性分析，天生就对这种固定不变的“先天优势”不敏感。
我们来看两个生活中的例子：
例子一：医院科室的黄金搭档
想象在一个医院科室里，有两位医生：
-
王主任（基因A） ：经验丰富，他的月度绩效奖金基数是 20000元 。 -
李医生（基因B） ：刚入职的住院医师，月度绩效奖金基数是 5000元 。
王主任的奖金基数（ 基因长度 ）是李医生的4倍。但是，我们发现：
-
科室效益好的月份，王主任拿了24000元奖金，李医生拿了6000元。（都超额完成了20%） -
科室效益差的月份，王主任只拿了16000元，李医生只拿了4000元。（都只完成了80%）
虽然他们奖金的 绝对数额 相差巨大，但他们的 变化模式(节奏) 是完全同步的！如果你去计算他们奖金变化的相关性，结果会非常高。王主任那个“4倍基数”的先天优势，完全没有影响我们判断他们是不是“黄金搭档”。
例子二：不同温标下的天气同步
我们要比较过去一年里， 北京（基因A） 和 纽约（基因B） 的每日气温变化模式是否同步。
-
北京用的是我们熟悉的 摄氏度（°C） 。 -
纽约用的是 华氏度（°F） 。
我们知道，华氏度 ≈ 摄氏度 × 1.8 + 32。这里的
× 1.8
，就完美地模拟了“基因长度”这个固定不变的“先天优势”。
尽管北京和纽约的气温 绝对值 完全不同（比如北京25°C时，纽约是77°F），但只要它们都是夏天热、冬天冷，这两条温度曲线的 变化模式（节奏） 就是高度同步的！如果你去计算它们变化的相关性，结果会非常高。
那个
× 1.8
的“先天优势”，完全没有影响我们判断它们的节奏是不是合拍。
结论：我们到底该处理什么？
既然WGCNA不在乎基因长度这个“固定优势”，那我们在准备数据时，就应该专注于解决那些它真正在意的问题：
-
测序深度 ：这是一个在不同样本间变化的因素，会影响所有基因，所以必须校正。 vst和rlog等方法完美地解决了这个问题。 -
数据的剧烈波动 ：有些基因的表达量波动范围特别大，会掩盖其他基因的变化模式。 vst和rlog的核心作用就是“稳定”所有基因的波动，让大家都在一个更公平的尺度上比较节奏。
总结一下就是，WGCNA分析之所以可以使用未经基因长度校正的数据，是因为它的核心算法——相关性分析，只关心变化的“模式”是否同步，而能够聪明地“忽略”掉基因长度这种固定不变的“先天优势”。我们进行
vst
或
rlog
转换，正是为了消除原始
Count
数据中那些真正会干扰“模式”判断的因素。
最后补充一句，我们要学会举一反三，比如下次做一种新的分析，需要了解我们手头上的数据类型和这种分析类型的特点，比如有些分析完全不需要处理基因长度的影响，因为在所有样本中都相互抵消了基因长度的影响。
所以学习分析类型的背后的原理也是很重要的，不然直接拿网上的代码，改成自己的数据来跑，图是能跑出来，但是一知半解。
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